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Glycotech 平行板流室中的動態(tài)流動測定
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Glycotech 合成碳水化合物聚合物和探針
噸在許多情況下，功能性碳水化合物結(jié)構(gòu)的研究需要用報告基團衍生分子以進行檢測，并以具有生物學(xué)意義的多價形式呈現(xiàn)。以下部分包含合成碳水化合物探針，其中碳水化合物被摻入聚丙烯酰胺基質(zhì)中，從而產(chǎn)生 30kd 多價聚合物。除非另有說明，否則聚合物鏈的大約每 5 個酰胺基團以 4:1 的比例被N 取代，而其他的則以 20:1 的比例含有熒光素。多價聚合物可與鏈霉親和素報告試劑一起用于酶免疫測定、與其他熒光基團偶聯(lián)或固定在固體支持物上。在不需要多價的情況下，也可以使用單價化探針。在最后一組中，可以使用含有不同摩爾比并因此具有不同碳水化合物基團密度的聚合物組。雖然這些探針涵蓋了廣泛的碳水化合物序列，但可根據(jù)要求定制合成特定的碳水化合物聚合物。
Glycotech 平行板流室中的動態(tài)流動測定
John T. Patton~GlycoTech Corporation, 羅克維爾, 馬里蘭 20850
F low 測定允許在明確的壁剪切應(yīng)力下可視化細胞粘附。細胞粘附的不同事件的可視化可以通過選擇性圖像采集和隨后的圖像處理來量化。流動測定特別適用于研究在比大多數(shù)靜態(tài)粘附測定更短的時間尺度內(nèi)非常迅速地發(fā)生的粘附事件。此外，可以研究初始事件之后的事件，例如細胞穩(wěn)定和擴散，從而深入了解特定細胞-細胞或細胞-基質(zhì)粘附行為的動力學(xué)。
材料：
顯微鏡：
配置用于相差和熒光操作的倒置顯微鏡
物鏡（6.3 x、10 x、40 x）
舞臺孵化器
生物：
細胞懸液（中性粒細胞、癌細胞）
35 mm 培養(yǎng)皿中的細胞單層或涂層基質(zhì)
粘附培養(yǎng)基（不含血清的培養(yǎng)基，含 12 mM Hepes）
纖連蛋白（人血漿）
牛血清白蛋白 (BSA)
流室系統(tǒng)：
帶墊圈和管接頭的流動室甲板
35 mm 組織培養(yǎng)皿
哈佛注射泵
安裝在泵上的玻璃注射器（3、5、20 或 60 cc）
硅膠管
旋塞閥
真空泵
電腦/電子：
數(shù)字圖像采集處理系統(tǒng)
顯示器
錄像機
帶控制器的CCD相機
時間日期生成器
具有圖像系統(tǒng)接口的計算機
圖像存儲設(shè)備
協(xié)議：
細胞單層制備
1. 在每個培養(yǎng)皿中加入 1 ml 5.5µg/ml FN 溶液，用人纖連蛋白 (FN) 涂抹培養(yǎng)皿。
2. 孵育 30 分鐘。在室溫下。
3. 從每個盤子中吸出溶液。
4.根據(jù)達到匯合所需的時間，以0.5-3.0 x 10 5 個細胞/ml的接種密度向每個培養(yǎng)皿中加入 2 ml 細胞懸浮液（Huvecs、CHO 細胞） 。
5. 1-5 天后，在流式分析中使用具有融合單層的培養(yǎng)皿。每 2-3 天喂一次細胞，但通常不是 48 小時。的流量測定。
涂層基材制備
1. 用記號筆在每個培養(yǎng)皿的中心畫出一個涂層區(qū)域（直徑 5 毫米），用于涂層基材。
2. 將 20μl 含底物的溶液（濃度為 10μg/ml）加入涂層區(qū)域。孵育 1 小時。
3. 吸出液體，加入 20µl 1% BSA 封閉 1 小時。
4. 吸出 BSA，加入 20µl 抑制劑 1 小時。
5. 培養(yǎng)皿已準(zhǔn)備好用于流式分析。
使用平行板流動室進行流動分析
1. 打開載物臺培養(yǎng)箱，將粘附介質(zhì)加熱至 37°C 1 小時。在開始流動測定之前。
2. 組裝將入口、出口和真空管線連接到流動室甲板的流動系統(tǒng)裝置。用介質(zhì)填充系統(tǒng)并清除系統(tǒng)中的所有空氣。
3. 用細胞懸液填充入口容器。對于使用細胞單層的測定，建議使用 10 6 個 細胞/ml。對于涂層底物檢測，使用 10 5 個細胞/ml。
4. 將培養(yǎng)皿倒置，將培養(yǎng)皿固定到流動室培養(yǎng)皿上，在流路區(qū)域放置一小團培養(yǎng)基，然后將 35 mm 培養(yǎng)皿放在培養(yǎng)皿上。真空將盤子放在甲板上。確保盤子附在流動路徑中沒有氣泡。
5. 將組裝好的腔體放在顯微鏡臺上。
6. 以 0.1-4.0 達因/cm 2范圍內(nèi)的剪切應(yīng)力啟動連接到出口流動室的細胞注射泵流動。
7. 讓細胞流動足夠的時間以獲得足夠數(shù)量的細胞與細胞單層或涂層表面相互作用。一般3-10分鐘。用來。
8. 開始圖像采集。在盤子上的 7-10 個位置收集圖像。通常，在給定的實驗條件下，3 道菜提供了足夠的數(shù)據(jù)來顯示處理之間的統(tǒng)計差異。
9. 在所有培養(yǎng)皿上采集圖像后，進行圖像分析以量化流動測定。
參考：
(1) Lawrence, MB, McIntire, LV, Eskin, SK, (1987)，流動對多形核白細胞/內(nèi)皮細胞粘附的影響，血液70：1284-1290。
(2) Patton, JT, Menter, DG, Benson, DM, Nicolson, GL, McIntire, LV, (1993)，在平行板室中流動的腫瘤細胞的計算機分析以確定它們的粘附穩(wěn)定滯后時間、細胞運動性和細胞骨架26：88-98。
(3) Jones, DA, Abbassi, O., McIntire, LV, McEver, RP, Smith, CW, (1993)，P-選擇素介導(dǎo)嗜中性粒細胞在組胺刺激的內(nèi)皮細胞上滾動，生物物理學(xué)雜志65：1560-1569。
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